I-131标记HER2特异性sdAbs用于表达HER2癌症的放射性药物的治疗评估
近日，杜克大学医学中心Michael R. Zalutsky团队在Scientific Reports发表了131I标记的单域抗体片段（sdAbs）用于HER2阳性的肿瘤动物模型的疗效。在这项研究中，VHH_1028使用残余修复剂N-琥珀酰亚胺3-胍甲基5-[131I]碘苯甲酸酯（iso-[131I] SGMIB）进行标记，并在表达HER2的SKOV-3卵巢癌和BT474乳腺癌异种移植模型中评估其组织分布。在与[131I]SGMIB-2Rs15d（一种目前正在进行临床研究的HER2靶向放射性药物）的头对头比较中，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028表现出明显更高的肿瘤摄取率和明显更低的肾脏累积。结果表明，在SKOV-3和BT474异种移植模型中，肿瘤与肾脏的辐射剂量比分别是2.9和6.3倍。Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的制备采用了一种固相萃取法来纯化修复剂中间体Boc2-iso-[131I]SGMIB，该方法可重复扩大到治疗级的剂量，并避免了HPLC纯化的需要。单剂量（SKOV-3）和多剂量（BT474）治疗方案表明，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的耐受性良好，并提供了明显的肿瘤生长延迟和生存期延长。这项研究表明，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028是一种有潜力的候选药物，可用于表达HER2癌症的RPT，值得进一步开发。
研究背景
放射性药物治疗（RPT）是一种用于治疗弥漫性癌症的极具潜力的策略，包括那些过度表达HER2受体的癌症如乳腺癌、卵巢癌和胃食道癌等。由于RPT的生物靶向性，它可以大大增加病人的生存率，而且副作用比传统的外照射要少。RPT需要巧妙结合放射性原子和肿瘤靶向载体，并且用适当的方法连接两者。来源于骆驼科动物的13-15kDa单域抗体片段sdAbs（也被称为纳米抗体或VHH分子）由于在肿瘤中迅速积累、并且比完整的抗体更快地从正常组织中清除，为RPT提供了一个理想的平台。
使用sdAbs以及类似分子量的工程支架蛋白，面临的挑战是如何实现肿瘤高摄取率的同时，避免放射性在肾脏的过度积累。虽然放射性金属的残留特性有助于解决前者，但同时也会加剧后者，导致肾脏活性水平在RPT上不可接受。这种局限性通常与放射性金属有关；然而，这并不是这些放射性结合物所独有的。使用含有多个带负电荷的D-氨基酸的高残留修复剂放射性碘化的sdAb也遇到了类似的困难。当使用N-琥珀酰亚胺-4-胍甲基3-[131I]碘苯甲酸酯（[131I]SGMIB）标记sdAbs时，获得了更为有利的结果，这种药剂结合了良好的肿瘤残留性和快速肾脏排泄的放射性标记的代谢物的特性。
人表皮生长因子受体2型（HER2）一直是最为广泛研究的分子，用于将放射性标记的sdAbs靶向肿瘤。这种跨膜受体经常在乳腺癌、胃癌和卵巢癌中表达。此外，HER2过度表达是无病生存率降低和转移性疾病的预兆。特别是对于脑部转移（HER2阳性乳腺癌患者常见的致命表现），与现有的HER2靶向完整抗体及其药物结合物相比，sdAbs的较小体积可能更为有利。
虽然HER2靶向完整抗体（mAbs）在肿瘤中的摄取率高且时间长，但其从正常组织中清除的速度慢，这也影响了其RPT的潜力，因为其肿瘤穿透性差。另一方面，经过改进的sdAbs的亲和力与完整mAbs相当，并可从正常组织中快速清除，在某些情况下，可以实现几乎与完整的mAbs一样高的肿瘤摄取率。用于RPT的sdAbs的主要缺点是高肾脏摄取，如上所述，在临床前模型中，放射性金属的摄取通常比放射性碘更明显。
最近报道了对最终用于RPT的放射性标记的HER2靶向sdAb的首次临床评估。虽然用177Lu标记的对应物观察到了更好的治疗反应，但[131I]SGMIB-2Rs15d提供了以远不可能引起肾脏毒性的剂量方案实现肿瘤控制的可能性，因此[131I]SGMIB-2Rs15d被选为进一步开发的对象。
2Rs15d与HER2的Domain I结合，避免了与曲妥珠单抗（Domain IV）和帕妥珠单抗（Domain II）的竞争。然而，与此相一致的是，观察到表达HER2的癌细胞对[131I]SGMIB-2Rs15d只有中等程度的内化和捕获。尽管不像HER2靶向抗体-药物结合物那样是一个关键因素，但将与HER2结构域结合的sdAb与残留标记剂结合起来，可能是一种诱人的RPT策略。之前，我们评估了anti-HER2 sdAb 5F7的潜在效用，它与跟曲妥珠单抗抗体-药物偶联物(ado-trastuzumab emtansine) 相同的HER2 的Domain IV表位结合，作为开发HER2 RPT制剂的递送载体。与预期相同，使用[131I]SGMIB对5F7进行标记时，观察到其在体外的高度内化和体内的肿瘤定位能力。令人惊讶的是，用结构相似的N-琥珀酰亚胺-3-胍甲基5-[131I]碘苯甲酸酯（iso-[131I]SGMIB）进行标记，与[131I]SGMIB-5F7相比，肿瘤摄取量明显增加，肾脏清除更快，脱卤更少，这使得iso-[131I]SGMIB-5F7成为RPT的兴趣。
由于5F7的CDR区域中有一个赖氨酸结合标记位点，因此可能会出现HER2结合障碍，特别是当标记临床RPT可能需要的高特异性活性时。出于这个原因，作者创建了sdAb VHH_1028，并将其设计成在CDR区域中不包含赖氨酸连接点。在此，作者评估了新型iso-[131I]SGMIB-VHH_1028共轭物的特性及其在HER2表达的癌症的RPT中的潜在效用。
研究结果
规模化生产iso-[131I]SGMIB-VHH_1028
精简的合成和使用固相萃取（SPE）方法进行纯化的细节显示在图1A中，每个合成的实验细节在图1B中给出。采用固相萃取法共进行了13次Boc2-iso-[131I]SGMIB的合成，其放射化学产率（RCY）为48.5±5.6%。采用SPE方法，从最初的131I活性水平0.19GBq到8.7GBq，都能成功地进行标记，并有一致的RCY。通过正相HPLC测定，除了在合成大于4小时后进行分析的某些情况，Boc2-iso-[131I]SGMIB的放射化学纯度（RCP）大于90%。VHH_1028与iso-[131I]SGMIB共轭标记的RCY为39.8±11.2%；通过SDS-PAGE/荧光成像，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的RCP为96.7±8.1%。由于实际原因，没有对所有批次的产品进行免疫活性和基于细胞的亲和力检测。Iso-[131I]SGMIB- VHH_1028免疫反应比例为81.9±10.1%（n = 6），其与表达HER2的SKOV-3细胞结合的Kd值在三个治疗级别的批次中分别为1.5±0.3 nM、2.9±0.5 nM和2.6±0.5 nM。最多生产了5.4GBq的iso-[131I]SGMIB和1.2GBq的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028。Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的摩尔活性在0.97至29.38 GBq/µmol之间。批次7（图1B）被用于单剂量治疗研究，批次10-13被用于多剂量治疗研究。
图1. Iso-[131I]SGMIB的放大生产方法。(A) 硅胶凝胶柱纯化方法的描述。(B) 放射性标记和纯化参数。
细胞摄取、保留和内化
图2显示了BT474细胞对iso- [131I] SGMIB-VHH_1028的吸收、保留和内化结果。在4℃孵育1小时后，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028与BT474细胞的结合率为输入活性的28.0±0.7%，当细胞与曲妥珠单抗共同孵育时，该结合率降至0.33±0.4%（图2A），证实了细胞结合HER2的特异性。在4℃培养1小时后，64%至71%的结合物被细胞保留，在37℃的24小时实验中观察到细胞内的活性逐渐增加（图2B）。BT474细胞上的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的内化率常数ke是通过内化和膜结合活性之间的比率的线性回归确定的，并对过量曲妥珠单抗（0. 39-0.40%）存在下的结合进行校正，计算出的ke值为（2.63±0.31）×10-5（s-1）（95%置信区间：R2=0.8471），这与之前在该细胞系上测量的曲妥珠单抗相似。
图2.Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028对HER2-阳性BT474乳腺癌细胞的细胞摄取、保留和内化试验。
生物分布研究
在同一类群的异种移植小鼠中，以相同的方式测定iso-[131I]SGMIB-VHH_1028和[131I]SGMIB-2Rs15d的生物分布，并在两种放射性结合物之间进行随机分配。表1和表2列出了在BT474乳腺癌异种移植的NOD SCID小鼠中获得的结果。在所有时间点上，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的肿瘤摄取量都高于[131I]SGMIB- 2Rs15d，除了1小时（27.6±10.0% ID/g vs. 17.1±6.0% ID/g；P = 0.0789），其他时间点上的差异都很明显（P = 0.0056-0.0296）。在24小时，观察到iso-[131I] SGMIB-VHH_1028的肿瘤输送优势超过2倍（14.0 ± 6.0% ID/g vs. 5.7 ± 1.3% ID/g）。除肾脏外，两种131I标记的sdAbs从正常组织中的清除都很迅速，在某些情况下观察到组织保留的微小差异。Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028在肾脏中的活性水平在1小时为48.3±6.9% ID/g，4小时为3.8±0.9% ID/g（P = 0.0067），8小时为1.3±0.2% ID/g。这些数值明显低于[131I]SGMIB-2Rs15d的观察值，后者在1小时为74.1±14.2% ID/g（P = 0.0065），4小时时为15.4±7.1% ID/g（P = 0.0067）和8小时为7.1±4.9% ID/g（P = 0.0295）。
表1.[131I]SGMIB-2Rs15d在携带BT474异种移植的NOD SCID小鼠中的生物分布。aMean ± SD (n = 5).
表2.Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028在携带BT474异种移植的NOD SCID小鼠中的生物分布。 a Mean±SD（n = 5）。
辐射剂量测定
使用以上生物分布数据来估计在小鼠身上进行的假设剂量为37MBq的疗效研究中，肿瘤和肾脏会接受到的辐射剂量。在SKOV-3模型中，在肾脏（假定的剂量限制器官）的同等辐射剂量下，与[131I]SGMIB-2H_1028相比，使用iso-[131I]SGMIB-2Rs15d可向肿瘤提供2.9倍的辐射剂量（表 3）。同样，与[131I]SGMIB-2Rs15d相比，使用iso-[131I]SGMIB-VHH_1028可向BT-474肿瘤提供6.3倍的辐射剂量。
表3.假设剂量为37MBq时，[131I]SGMIB-2Rs15d和iso-[131I]SGMIB-VHH_1028对肾脏和肿瘤的吸收累积辐射剂量估计。
使用BT474模型数据集，用MIRD方法估计了人类的辐射吸收剂量和有效剂量（补充表S3）。Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028和[131I]SGMIB-2Rs15d的有效剂量分别为0.148 mSv/MBq和0.105 mSv/MBq，估计肾脏的辐射吸收剂量分别为0.25和0.44 mSv/MBq。
补充表S3。[131I]SGMIB-2Rs15d和iso-[131I]SGMIB-VHH_1028对成年女性不同器官的辐射剂量估计。
Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028疗效
如图3A所示，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028治疗只需单剂量就能使肿瘤生长明显延迟。在56MBq（P = 0.0442）、28MBq（P = 0.0145）和10MBq剂量下，治疗组达到初始肿瘤体积200%的时间明显长于对照组（P = 0.0289）。当每只动物的肿瘤体积被归一化为治疗时的体积（图3B），并通过配对t检验进行分析，早在第17天就观察到明显的肿瘤生长延迟，与对照组相比，高、中、低剂量的P值分别为0.0199、0.0081和0.0357。治疗组之间的肿瘤生长延迟差异没有统计学意义。56、28和10MBq剂量以及对照组的中位生存期分别为51、71、50和41天（图3C）。根据Log-rank（Mantel-Cox）检验（P<0.0001）和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验（P=0.0002），与对照组相比，只有中剂量组有明显的生存福利。治疗组和对照组之间没有观察到体重的明显差异（图3D），也没有观察到明显的毒性迹象。
图3.单剂量的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028对SKOV-3异种移植小鼠的疗效。
接下来，用BT474异种移植的NOD SCID小鼠进行了多剂量治疗实验。所有iso-[131I]SGMIB-VHH_1028组都观察到明显的和剂量依赖性的肿瘤生长抑制（图4A），30、18和10MBq剂量组的肿瘤生长抑制（TGI%）分别为95.7±43.7%、95.4±69.2%和61.1±32.2%（图4B）。成对t检验表明，与对照组相比，所有治疗组都有明显的肿瘤生长抑制作用（P<0.0001），不同剂量水平之间也是如此（30与18MBq、30与10MBq、18与10MBq组的P<0.0001）。
图4.四种剂量的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028对SCID小鼠BT474异种移植的肿瘤生长的影响。
细胞摄取、保留和内化
在BT474异种移植实验中，有4只小鼠在研究期间表现出完全反应（CR，100%消退）（图5A）。在30MBq组中，2只小鼠表现出完全反应，6只小鼠有部分反应（PR，>30%的消退），总反应率（ORR）为80%。在18和10MBq组中也观察到一个完全反应。不幸的是，大多数小鼠因雌激素颗粒诱导的尿石症而出现并发症并且死亡，这是该模型的一个已知并发症。对照组有两只小鼠，10、18和30MBq组分别有4、9和7只小鼠因尿石症引起的毒性而死亡，这些都是通过尸检确定的。补充图S7显示了本研究中一只正常小鼠和一只未经治疗的小鼠膀胱严重肿大、尿石阻塞的解剖图。
图5.评价四种剂量的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028在有皮下BT474异种移植的SCID小鼠中的治疗疗效。与ER颗粒植入有关的尿石症导致的动物死亡被标明。
补充图S7.(A) 植入0.72mg雌激素颗粒的小鼠，随后用PBS处理，但仍由于膀胱堵塞出现尿石症而死亡。(B) 在没有接受雌激素颗粒植入的健康小鼠身上发现的比较性膀胱。 膀胱以红色圈出。
30、18和10MBq剂量组和对照组的中位生存期分别为23、26、103和58天（图5B）。只有低剂量组观察到明显的生存福利[P = 0.0007，log-rank（Mantel- Cox）检验；P = 0.0041，log-rank趋势检验；P = 0.0022，Gehan-Breslow-Wilcoxon]。值得注意的是，这些动物的主要死因是由于雌激素颗粒诱导的尿石症并发症（图5B）。经处理的小鼠的归一化平均体重与对照组小鼠无明显差异（双尾配对t检验；30MBq与对照组（P = 0.794）；18MBq与对照组（P = 0.808）；10MBq与对照组（P = 0.237）。没有观察到急性或长期治疗相关毒性的明显迹象。
讨论
✎对于HER2这样的内化肿瘤相关靶点，使用sdAbs放射性碘化的残留修复剂已经显示出巨大的潜力，尤其是在肾脏中较低的放射性捕获，与放射性金属标记的同类药物相比具有实质性优势。关于目前和未来旨在优化靶向HER2 sdAbs用于RPT的努力，至少在现有的放射化学方法中，与放射性金属相比，放射性卤素在标记sdAbs方面有明显的优势。
✎针对HER2领域IV的5F7 sdAb表现出卓越的肿瘤靶向性和内化特性，与2Rs15d相比似乎更具优势。然而，5F7 sdAb的CDR环包括一个可能发生共轭标记的赖氨酸，可能会对HER2的结合和随后的内化产生不利影响。为了避免这个潜在问题，VHH_1028被设计和改造成具有纳摩尔亲和力的HER2域IV，但在其CDR环中没有潜在的共轭位点存在。SPR试验证实，VHH_1028和其1:1的未标记的iso-SGMIB-VHH_1028结合物对HER2的结合给出了相同的Kd，即0.21 nM。
✎对于像sdAbs或肽这样的小蛋白，肾脏是最有可能限制剂量的组织。在两种异种移植模型中，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的肾脏峰值水平明显低于[131I]SGMIB- 2Rs15d，而且肾脏清除速度更快。基于这些数据集的辐射剂量计算（表3）表明，在保持肾脏的辐射剂量相同时，在SCID/BT474和anthymic/SKOV-3小鼠模型中，用iso-[131I]SGMIB-VHH_1028比[131I]SGMIB-2Rs15d分别多释放2.1和1.9倍的放射性。
✎与[131I]SGMIB-VHH_1028相比，特别是在BT474异种移植模型中， iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的肿瘤对131I活性吸收更高、保留时间更长。在SKOV-3和BT474模型中，每37MBq的辐射剂量也较高，分别为10.03和37.98 Gy。我们推测，这种肿瘤递送优势可能反映了VHH_1028与2Rs15d相比具有更快的导通率和更广泛的内化，这些特性应该在快速清除的VHH分子能够离开血池之前促进肿瘤的结合和保留。综上所述，肾脏和肿瘤辐射剂量的结果表明，与[131I]SGMIB-VHH_1028相比，在SKOV-3模型中，iso-[131I]SGMIB-2Rs15d可以提供近3倍的治疗指数，在BT474模型中则有6.3倍的优势。因此，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028被选中作为治疗性放射性药物在两种HER2表达的动物模型中进行进一步研究。
✎本文使用iso-[131I]SGMIB通过SPE方法纯化的iso-[131I]SGMIB-VHH_1028获得了优异的放射化学纯度、免疫反应性和结合亲和力。产生了最大1.2GBq的产量，据我们所知，这是报道的131I标记的sdAb的最高数量。
✎在SKOV-3异种移植的裸鼠中以单剂量形式研究了iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的疗效。根据剂量学计算，56MBq的用药量只向肾脏提供了2.91Gy的吸收剂量，远远低于外照射治疗所预测的23Gy的肾脏毒性阈值。
结论
一、在靶向HER2的 [131I]SGMIB-2Rs15d进入临床试验的鼓舞下，本文作者开发了iso-[131I]SGMIB-VHH_1028，它具有几个突出的设计特点：一个赋予更有利的体内特性的修复剂和一个具有更高HER2结合亲和力和更好内化的抗HER2 sdAb。在两个动物模型中进行的头对头生物分布实验证实，与[131I]SGMIB-VHH_1028相比，iso-[131I]SGMIB-2Rs15d表现出更高和更长时间的肿瘤积累，而肾脏水平更低。因此，在SKOV-3模型中，iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的肿瘤肾脏辐射剂量比是2.9倍，在BT474模型中是6.3倍。Iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的疗效研究显示了良好的肿瘤生长抑制和生存福利。此外，单次剂量高达56MBq的耐受性良好，辐射剂量学计算表明，甚至更高的活性水平也可以施用而不引起肾脏毒性。
二、在本研究的放射化学方面，Boc2-iso-[131I]SGMIB是利用一种基于SPE的纯化方法在高活性水平上产生的，而不需要使用HPLC。据我们所知，iso-[131I]SGMIB和iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的活性水平高于以前报道的任何131I标记的修复剂及其蛋白结合物。即使是在病人RPT所需的剂量下，这些放射化学程序应有助于iso-[131I]SGMIB-VHH_1028的临床转化。这些方法应该适用于用iso-[131I]SGMIB标记sdAbs和其他小蛋白；然而，初步实验表明，由于立体的限制，扩展到[131I]SGMIB异构体将是困难的。
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