【文献分享】对HER2靶向sdAbs的位点特异性放射卤化策略

sdAbs即单域抗体片段（Single-domain antibody fragments），也被称为VHH分子和纳米抗体（nanobodies），能够将放射性核素选择性地传递给肿瘤细胞，是核成像（nuclear imaging）和靶向放射性核素治疗（targeted radionuclide therapy，TRT）的优势平台。与全长mAbs相比，sdAbs有许多优点，有些与它们的尺寸小10倍有关（即快速的肿瘤穿透和正常组织清除），有些则与它们的生物特性有关（即高结合亲和力、易于生产、化学和热稳定性）。

将sdAbs与发射α粒子的放射性卤素²¹¹At结合后用于TRT是极具吸引力的策略，因为该放射性核素的7.2小时物理半衰期与sdAbs的药代动力学特征非常一致。此外，α-粒子发射的短组织范围和高效力将在sdAbs最有可能产生治疗效果的转移性疾病中别具价值。在最近的一项治疗研究中，iso-[²¹¹At]-SAGMB-5F7和VHH_1028结合物对HER2阳性的BT474乳腺癌异种移植动物模型显示出良好的治疗效果；大多数接受治疗的小鼠的肿瘤完全消退，并且在治疗后200天没有观察到明显的毒性迹象。

但使用像iso-[²¹¹At]SAGMB这样含有活性酯的放射性标记残基的一个缺点是，它们可以与sdAb内的多个赖氨酸残基反应，产生具有不同性质的放射性结合物的混合物。而通过位点特异性放射性标记、在生物分子的单一位置进行修饰，是规避这些问题的一个有效方法。

图1. (A)单克隆抗体(mAb)和单域抗体(sdAb)的结构和相对大小示意图；(B)5F7GGC的带状图（顶部）和氨基酸序列（底部），说明互补决定区（CDRs）、赖氨酸残基（K）和C端GGC连接点的位置。(C)[²¹¹At]MEAGMB和[¹²⁵I]MEGMIB的结构；(D)iso-[¹³¹I]GMIB-PODS和iso-[²¹¹At]AGMB-PODS的结构；(E)[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PODS的结构。

化学和放射化学。

新型试剂的放射合成在方案1-3中进行了总结。iso-GMIB-PODS-5F7GGC、DOTA-PODS-5F7GGC和Lu-DOTA-PODS-5F7GGC的合成产率相似（∼76%）。以上免疫结合物的纯度是用凝胶渗透高效液相色谱法（GP-HPLC）测定的，所有的纯度都大于95%。非放射性的iso-SGMIB-PODS被用来作为鉴定其放射性标记类似物iso-[¹³¹I]GMIB-PODS的标准。Boc₂-iso-[¹³¹I]GMIB-PODS的放射化学产率（RCY）和放射化学纯度（RCP）分别为70±8%（n=11）和>99%（RP-HPLC）。

iso-[¹³¹I]GMIB-PODS与单体5F7GGC的结合以58±9%的RCY（n = 11）完成；通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和GP-HPLC测定的iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的RCP为>99%。iso-[²¹¹At]AGMB-PODS的合成RCY为66±5%（n = 6），且每次合成的RCP都>99%。iso-[²¹¹At]AGMB-PODS与5F7GGC结合的RCY为64±7%（n=6），通过SDS-PAGE和GP-HPLC测定的放射性标记sdAb的RCP为>99%。[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PODS的合成产率几乎是定量的，[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PODS-5F7GGC的RCY为35±15%（n = 2），通过SDS-PAGE和GP-HPLC测定得RCP>99%。

sdAb结合物的表征。

使用重组HER2-Fc蛋白进行的表面等离子体共振（Surface plasmon resonance ，SPR）检测显示，iso-GMIB-PODS-5F7GGC、DOTA-PODS-5F7GGC和Lu-DOTA-PODS-5F7GGC的结合常数（K_d）为0.10、0.19和0.09 nM（图2）。使用表达HER2的SKOV-3和BT474细胞系进行饱和结合试验（Saturation binding assays），iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的K_d值分别为3.3 ± 0.5 nM和5.9 ± 0.8 nM（图3）。使用BT474细胞系，iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC、[²¹¹At]-MEAGMB-5F7GGC和[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-5F7GGC的K_d值分别为4.7±0.8、3.4±0.6和5.6±0.9 nM。

图2.通过表面等离子体共振（SPR）测量的5F7GGC和5F7GGC-结合物对HER2胞外域的结合亲和力（K_d）。使用多循环动力学滴定法测定5F7GGC的K_d，使用单循环动力学滴定测定5F7GGC结合物。

图3. 放射标记的sdAb结合物的质量控制。(A）iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC（a）、[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC（b）、iso-[211At]AGMB-PODS-5F7GGC（c）和[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-5F7GGC（d）的SDS-PAGE和荧光成像; (B)在BT474细胞中测得的iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的结合亲和力；(C)在SKOV-3细胞中测得的iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的结合亲和力；以及（D）在BT474细胞中测得的iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC的结合亲和力。

细胞保留和内化。

通过配对标记内化试验（paired-label internalization assay）比较iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC和[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC：与[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC相比，iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC在37℃培养4小时后表现出更高的细胞内保留率，这可能说明与[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC相比，iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的体外稳定性更高（图4）。

图4. 对HER2阳性的BT474乳腺癌细胞与[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC和iso-[¹³¹I]GMIB-PODS 5F7GGC共同培养的体外配对标记内化试验。结果显示为4℃培养1小时后最初与细胞结合的放射性的表面结合（左）和内化（右）部分。

在配对标记试验中（图5），比较了iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GG与iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC的细胞摄取和内化: iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC的细胞吸收和细胞内保留与iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC没有明显区别，这与两种结合物在体外条件下的脱卤程度低是一致的。

图5. 对HER2阳性的BT474乳腺癌细胞进行体外成对标记内化试验，与iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC和iso-[²¹¹At]AGMB-5F7GGC共同培养。结果以4℃下培养1小时后最初与细胞结合的放射性的表面结合部分（左）和内化部分（右）表示。

[²¹¹At]MEAGMB-5F7GGC和iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC的体外稳定性。

²¹¹At标记的sdAbs的体外稳定性结果显示在图6。在PBS、半胱氨酸和HSA中观察到iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC有很好的稳定性。相比之下，iso-[²¹¹At]MEAGMB-5F7GGC在半胱氨酸和HSA中3小时内迅速降解。

图6. (A)iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC和(B) [²¹¹At]MEAGMB-5F7GGC在PBS、50mM半胱氨酸（Cys）和人血清白蛋白（HSA，50%, PBS）中的体外稳定性。稳定性是通过SDS-PAGE和荧光成像确定的。

生物分布。

iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC和[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC的生物分布在无（表1）和有（表2）BT474皮下异种移植的无胸腺小鼠和中进行了比较。在没有肿瘤的小鼠中，注射后1小时，iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC在肾脏中的放射性吸收（36.3±5.2% ID/g）明显高于[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC（15.7±1.3% ID/g；P < 0.005）。然而，在注射后4小时，两种放射免疫结合物产生的肾脏活性浓度没有明显差异（P>0.05）。iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC的肾脏活性水平比iso-[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC的肾脏活性水平下降得更快，从1到4小时分别下降了约12倍和6倍。作为更快清除的结果，iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC在24小时的肾脏活性水平比iso-[¹²⁵I]MEGMIB-5F7GGC低。

通过BT474异种移植无胸腺小鼠的配对标签实验（paired-label experiment），直接比较了iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC和其²¹¹At标记的类似物iso- [²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC的生物分布（表3）。两种结合物都有较高的肿瘤摄取和保留，而且两种结合物之间的差异没有统计学意义（1、4和21小时 P>0.05）。

当iso- [²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC作为单剂在BT474异种移植的无胸腺小鼠中进行评估时，除了4小时和24小时的肿瘤摄取量外，组织中放射性活度水平与配对标签研究中看到的一致（表4）。在单标签研究（single-label study）中，肿瘤摄取量高出2倍：4和24小时分别为20.5±2.4% ID/g和8.8±0.8% ID/g。

进行了一项生物分布研究，以直接比较iso-[¹²⁵I]GMIB-PODS-5F7GGC和[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PODS-5F7GGC在BT474异种移植的无胸腺小鼠体内的表现（表5）：肿瘤对iso-[¹²⁵I]GMIB-PODS-5F7GGC的吸收水平与用¹⁷⁷Lu标记的PODS-5F7GGC的吸收水平相当甚至更好。

1.sdAbs是进行位点特异性硫醇修饰的理想结构。

因为sdAbs通常只有一个对大多数还原条件稳定的保守的二硫化物连接，而且由于sdAbs的C端指向远离其CDR区域，意味着它有一个破坏抗原结合亲和力的可能性最小的极好的修饰位置。该研究使用重组方法在anti-HER2 sdAb 5F7的C端增加一个GGC序列，以引入一个单半胱氨酸进行位点特异性标记。使用PODS进行位点特异性标记仅产生一个物种，提供了比较金属和卤素sdAb标记策略的机会，同时排除了异质性作为混杂变量。

2.砹-211在之前随机标记的结合物中的疗效远优于碘-131类似物，因此启发了作者团队对于砹-211位点特异性标记的研究。

在作者之前的研究中，用随机标记的5F7和其生物等价物VHH_1028进行动物实验，与¹³¹I标记的结合物相比，²¹¹At标记的治疗效果要好得多。为此，作者团队的主要目标是开发一种用于²¹¹At放射性标记sdAbs（尤其是5F7）的位点特异性和生物稳定性的试剂。为了评估卤素对体内行为的影响，以成对标记的形式比较了iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC和iso-[¹³¹I]GMIB-PODS-5F7GGC。虽然在脾脏、胃和甲状腺中²¹¹At的水平明显高于¹³¹I的水平，但没有观察到²¹¹At和¹³¹I在肿瘤摄取方面的明显差异，这一结果与²¹¹At标记的sdAb的脱卤程度较高相一致。

3.基于PODS的结合物的体内稳定性更佳。

当iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC以单标记形式被评估时，其肿瘤摄取量约为同一模型中iso-[²¹¹At]AGMB-VHH_1028的两倍。此外，基于PODS的放射免疫结合物在胃、甲状腺和脾脏中的²¹¹At水平约低2倍，这表明它在体内比iso-[²¹¹At]SAGMB结合物更稳定。

文献报道了一种用含有残基化部分（residualizing moiety）和硫醇反应性（thiol-reactive）PODS官能团的修复剂（prosthetic agent）对sdAbs进行位点特异性放射卤化的方法。对于使用该策略衍生的结合物，保持了HER2结合的高亲和力。与iso-[²¹¹At]MEAGMB-5F7GGC相比，iso-[²¹¹At]AGMB-PODS-5F7GGC具有优异的体外稳定性和良好的肿瘤靶向性。这些结果表明，iso-[²¹¹At]AGMB-PODS作为一种α发射靶向放射药物治疗HER2表达恶性肿瘤的潜力值得进一步评估。